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紫外分光光度法測量蛋白質的含量

時間:2020-11-03 09:17:05來源:工采網 作者:川少 點擊:
紫外可見分光光度法是在190~760nm波長范圍內測定物質的吸光度,用于鑒別、雜質檢查和定量測定的方法。當光穿過被測物質溶液時,物質對光的吸收程度隨光的波長不同而變化。
紫外可見分光光度法是在190~760nm波長范圍內測定物質的吸光度,用于鑒別、雜質檢查和定量測定的方法。當光穿過被測物質溶液時,物質對光的吸收程度隨光的波長不同而變化。因此,通過測定物質在不同波長處的吸光度,并繪制其吸光度與波長的關系圖即得被測物質的吸收光譜。從吸收光譜中,可以確定最大吸收波長λmax和最小吸收波長λmin。物質的吸收光譜具有與其結構相關的特征性。因此,可以通過特定波長范圍內樣品的光譜與對照光譜或對照品光譜的比較,或通過確定最大吸收波長,或通過測量兩個特定波長處的吸收比值而鑒別物質。用于定量時,在最大吸收波長處測量一定濃度樣品溶液的吸光度,并與一定濃度的對照溶液的吸光度進行比較或采用吸收系數法求算出樣品溶液的濃度。

光譜法(spectrometry)是基于物質與電磁輻射作用時,測量由物質內部發生量子化的能級之間的躍遷而產生的發射、吸收或散射輻射的波長和強度進行分析的方法。光譜法可分為發射光譜法、吸收光譜法、散射光譜法;或分為原子光譜法和分子光譜法;或分為能級譜,電子、振動、轉動光譜,電子自旋及核自旋譜等。
分光光度法是光譜法的重要組成部分,是通過測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內的吸光度或發光強度,對該物質進行定性和定量分析的方法。常用的技術包括紫外-可見分光光度法、紅外分光光度法、熒光分光光度法和原子吸收分光光度法等。
物質對光的選擇性吸收波長,以及相應的吸收系數是該物質的物理常數。在一定條件下,物質的吸收系數是恒定的,且與入射光的強度、吸收池厚度及樣品濃度無關。當已知某純物質在一定條件下的吸收系數后,可用同樣條件將該供試品配成溶液,測定其吸光度,即可由上式計算出供試品中該物質的含量。在可見光區,除某些物質對光有吸收外,很多物質本身并沒有吸收,但可在一定條件下加入顯色試劑或經過處理使其顯色后再測定,故又稱之為比色分析。
蛋白質與生命的起源、存在和進化都密切相關,蛋白質測定涉及到生產和利研的眾多領域。本試驗用紫外分光光度法進行蛋白質含量的測定,由此分析此方法的特點及適用條件。結果表明,紫外吸收法簡單、迅速,且相對較為準確,是測定低濃度蛋白質含量的有效方法。
蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵,因此,蛋白質具有吸收紫外光的性質,其最大吸收峰位于280nm附近(不同的蛋白質吸收波長略有差別)。在最大吸收波長處,吸光度與蛋白質溶液的濃度的關系服從朗伯-比耳定律。該測定法具有簡單靈敏快速高選擇性,且穩定性好,干擾易消除不消耗樣品,低濃度的鹽類不干擾測定等優點。

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